Lección 22. Expresión e ingeniería de proteínas, y mutagénesis

  1. Transformación y transfección celular
  2. Expresión de proteínas
  3. La mutagénesis dirigida
  4. Ingeniería de Proteínas
  5. CRISPR

Para saber más:

The Nobel Prize in Chemistry 1993 to Michael Smith

"For his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies".

The Nobel Prize in Chemistry 2018 to Frances H. Arnold

"For the directed evolution of enzymes." and George P. Smith and Sir Gregory P. Winter "for the phage display of peptides and antibodies."

The Nobel Prize in Chemistry 2020 to Emmanuelle Charpentier and Jennifer A. Doudna

"For the development of a method for genome editing"

  1. Transformación. Es la incorporación de DNA exógeno a una bacteria. La bacteria debe estar en estado «competente» lo que se consigue permeabilizando la membrana (g. enfriando con Ca++ y calentando a 42 grados o mediante electroporación). Junto con el gen de interés se suele introducir uno que codifica resistencia a un antibiótico para poder seleccionar las colonias transformadas. La transformación de células eucariotas se denomina transfección y es transitoria pues el DNA introducido se suele perder cuando la célula se divide. Para que sea estable hay que poder seleccionar las pocas células que han incorporado el DNA a su genoma.
  2. Sistemas de expresión. El cultivo de un organismo transformado (o de células transfectadas) permite obtener la proteína expresada por purificación. Las bacterias (como coli) se cultivan rápida y fácilmente y son preferidas para obtener proteínas no muy grandes y sin modificaciones posttraduccionales. Si hay modificaciones, se suele recurrir a hongos (S. cerevisiae, P. pastoris) o, si están glicosiladas o necesitan chaperonas, a células eucariotas como células de insectos.
  3. Site-directed mutagenesis. Permite introducir la mutación deseada en un punto concreto de una molécula de DNA. Se utiliza en estudios estructura/función de DNA, RNA y proteínas y en Ingeniería de Proteínas (e.g. subtilisina M222→A Método clásico con un cebador. Se utiliza un cebador con la mutación deseada, que se hibrida al plásmido que contiene el gen. Se copia el gen con DNA polimerasa, se clona, se transforma y se secuencian colonias para identificar a las mutantes.
    • Con dos cebadores: se copia el plásmido entero usando un termociclador (no hay amplificación exponencial), se hidroliza la cadena metilada original, se transforma y se secuencia.
    • Síntesis directa: La síntesis directa del gen mutado ha empezado a competir con los métodos clásicos de la mutagénesis
  1. Ingeniería de proteínas. Proceso mediante el que se desarrollan proteínas útiles o valiosas. Su mercado estimado para 2017 es de 150.000 M€. Hay dos estrategias principales:
    • Diseño racional: basado en conocer la estructura tridimensional y la función de la proteína Ventaja: barato y técnicamente sencillo (mutagénesis dirigida). Inconvenientes: a veces no se dispone de la estructura y suele ser difícil calcular el efecto de las mutaciones.
    • Evolución dirigida: basado en mutagénesis al azar + selección. Ventaja: no requiere conocer la estructura ni saber calcular el efecto de las mutaciones. Inconvenientes: los métodos de alto rendimiento necesarios no son posibles para cualquier proteína y muchas actividades biológicas son difíciles de cribar.
  1. Los procariotas (40 % de bacterias y 90 % de arqueas) posen un sistema inmune que les permite adquirir resistencia a plásmidos y fagos exógenos. Los CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) son segmentos de DNA que contienen repeticiones entre las que se intercala DNA espaciador que procede de exposiciones previas a agentes infecciosos. Al ocurrir una nueva infección, los espaciadores de los CRISPR dirigen el corte del material genético invasor de forma análoga al RNA de interferencia de eucariotas. Hay tres familias de genes asociados a CRIPSR (genes cas) la más sencilla de las cuales es la II que se basa en el gen cas9 y que ha permitido desarrollar técnicas de edición genómica. Añadiendo proteína Cas9 y una molécula de RNA guía se puede cortar el genoma de un organismo en el punto deseado y conseguir silenciar un gen o introducir mutaciones específicas. La tecnología CRIPSR se está adaptando para conseguir base-editing (~site directed mutagénesis en eucariotas).