- Secuenciación de péptidos.
- Secuenciación de proteínas por el método de Sanger.
- Secuenciación de péptidos y proteínas mediante espectrometría de masas.
- Secuenciación de ADN por el método de Sanger.
- Secuenciación de ADN de segunda generación.
- Servicios de secuenciación de ADN.
The Nobel Prize in Chemistry 1958 to Frederick Sanger
"For his work on the structure of proteins, especially that of insulin"
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 Werner Arber, Daniel Nathans and Hamilton O. Smith
"For the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics"
The Nobel Prize in Chemistry to 1980 Paul Berg
"For his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA"
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959 to Severo Ochoa and Arthur Kornberg
"For their discovery of the ochoamechanisms in image010the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid"
The Nobel Prize in Chemistry 2002 to John B. Fenn and Koichi Tanaka
"For their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules"
The Nobel Prize in Chemistry 1980 to Walter Gilbert and Frederick Sanger
"For their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids"
- Secuenciación de péptidos. Los péptidos se pueden secuenciar (establecer el orden en que se encadenan los aminoácidos en la secuencia) automáticamente utilizando el reactivo de Edman que separa el aminoácido N-terminal del resto del péptido y lo derivatiza para que pueda ser detectado. Se realizan ciclos automáticos de separación e identificación cromatográfica. Más allá del aminoácido 30 el resultado ya no es fiable.
- Secuenciación de proteínas por el método de Sanger. Las proteínas se pueden secuenciar tras romperlas en péptidos de tamaño adecuado y separarlos por cromatografía. Para la rotura se emplean enzimas o reactivos que cortan en sitios específicos. Es necesario realizar dos roturas con reactivos diferentes para obtener dos conjuntos de péptidos, todos los cuales son secuenciados. Los péptidos de un conjunto tienen secuencias que solapan las de los péptidos del otro grupo y por comparación se puede establecer el orden en que se encadenan en la proteína entera. Es mucho más fácil y rápido determinar la secuencia de una proteína por secuenciación de su gen y traducción. Sin embargo, este procedimiento no identifica las modificaciones postraduccionales ni los puentes disulfuro. Existen servicios de secuenciación de pago (e.g.:este)
- Secuenciación de péptidos y proteínas mediante espectrometría de masas. Los péptidos se pueden secuenciar también por espectrometría de masas. Hay dos formas principales de transferir a fase gas moléculas de proteína completas: EEI: Electrospray ionization y MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization with Time of Flight detector. Estas técnicas permiten determinar con precisión el PM de la proteína. Para determinar la secuencia hace falta obtener fragmentos que se diferencien en 1 residuo. Habitualmente se hace mediante MALDI-PSD (Post source decay). En la práctica no se procesan proteínas completas sino fragmentos obtenidos por proteólisis. Existen servicios de secuenciación de pago (e.g. ver)
- Secuenciación de ADN por el método de Sanger. El método se basa en generar por replicación in vitro de un DNA molde segmentos copia con el mismo origen (en un cebador añadido) pero distinta longitud, que se separan por electroforesis en función de su longitud. Se llevan a cabo 4 reacciones que difieren en que en cada una de ellas está presente un ddNTP distinto (ddATP, ddGTP,…) cuya incorporación detiene el crecimiento del fragmento copia al incorporarse. Las cuatro reacciones se cargan en un gel de electroforesis y la posición de los fragmentos de DNA se revela por autorradiografía porque contienen radiactividad (originalmente el cebador estaba marcado con 32P; posteriormente parte de las moléculas de ATP para la síntesis contenían 35S). Posteriormente, la electroforesis en geles de acrilamida se sustituyo por electroforesis capilar, se empezó a usar la PCR para amplificar la muestra (y de ahí la señal) y se introdujeron dideoxiNTPs terminadores marcados fluorescentemente (4 colores distintos) de modo que bastaba hacer una reacción. La detección ya no era por autorradiografía sino por un lector láser de fluorescencia.
- Secuenciación de ADN de segunda generación. Nuevos métodos de detección: pirosecuenciación (con dATPαS), terminadores reversibles, liberación de protones. La secuenciación es muy rápida. Se paraleliza consiguiendo secuenciar muchos fragmentos a la vez. La información se trata conjuntamente con aplicaciones de alineamiento y ensamblado de secuencias. La secuenciación cada vez es más rápida y barata. Secuenciar 1 genoma cuesta 1000 euros (2016).
- Servicios de secuenciación de ADN. Existen servicios comerciales de secuenciación de adn (e.g. ver).
