- Microscopía electrónica
- El microscopio electrónico
- Preparación de muestras
- Reconstrucción de imagen
The Nobel Prize in Chemistry 1982 Aaron Klug
"For his development of crystallographic electron microscopy and his structural elucidation of biologically important nucleic acid-protein complexes"
- Microscopía electrónica. La microscopía electrónica resulta ideal para obtener estructuras de ensamblados macromoleculares de gran tamaño, presenta exigencias experimentales menores que Rayos X o RMN (no es necesario ni obtener cristales ni disponer de muestras muy concentradas o marcadas con isótopos no naturales) y, en sus formas más avanzadas (criomicroscopía electrónica), ofrece ya resolución atómica.
- El microscopio electrónico. El microscopio electrónico es bastante parecido al óptico y consta de una fuente de iluminación y un sistema de lentes que forman la imagen magnificada del objeto. La fuente de iluminación es un haz de electrones de pequeña longitud de onda (décimas de Å o menor) que permite, en teoría, alcanzar una elevadísima resolución subatómica.
- Preparación de muestras. El estudio de muestras biológicas plantea dos problemas: reducir el daño que provoca iluminación con electrones y las condiciones de vacío utilizadas, y aumentar el bajo contraste característico de las muestras biológicas. Resulta esencial preparar adecuadamente las muestras que se van a observar.
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- La técnica de tinción negativa consiste en sumergir el espécimen en una disolución de una sal de un metal pesado que desplaza al agua. El contraste se produce entre las solución metálica que dispersa fuertemente el haz de electrones y el espécimen que los dispersa poco. Un problema es que la resolución queda limitada por el tamaño de los granos de sal pesada a unos 15-20 Å
- La criomicroscopía electrónica se basa en congelar la muestra para protegerla del vacío y disminuir el daño por radiación. Además provocando congelaciones súbitas se consigue que el agua permanezca en forma vítrea con lo que no aparecen cristales de hielo que dañen al espécimen. El contraste es menor pero no se introducen límites a la resolución propia de la técnica.
- Reconstrucción de imagen. El principal problema de la criomicroscopía es el bajo contraste, que debe solucionarse aplicando técnicas de promediado de imagen.
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- El promediado es más sencillo cuando el espécimen es ordenado, ya sea intrínsecamente (estructuras helicoidales (DNA, virus, microtúbulos) y virus icosaédricos) o porque forme cristales bidimensionales (habitualmente proteínas de membranas). En estos casos se recurre a técnicas análogas a las empleadas por la difracción de rayos X (transformadas de Fourier). En primer lugar se toman fotografías con distintos ángulos de inclinación. Las fotos se digitalizan y se someten a transformada de Fourier. Se elimina el ruido propio debido a las imperfecciones del cristal o espécimen periódico y a la aberración de las lentes, y se hace la transformación inversa que proporciona una foto de mayor calidad. Combinando matemáticamente fotos obtenidas a distintos ángulos se reconstruye la imagen tridimensional.
- También se pueden promediar partículas individuales. El problema es que las partículas pueden diferir por estar orientadas de distinta manera, porque algunas estén dañadas o porque aparezcan en dos estados conformacionales. Por ello antes de promediar, para reducir el ruido, hay que utilizar programas de clasificación de las imágenes individuales. Para obtener la reconstrucción tridimensional es necesario tener fotos con distintas inclinaciones (bien porque el espécimen aparezca orientado de distintas maneras en una foto, bien porque se incline la preparación y se adquieran distintas fotos.
- Movimiento de los especímenes y los nuevos detectores de electrones. El bajo contraste de las muestras biológicas no se puede combatir aumentando la iluminación porque se produce daño químico en la muestra (los electrones rompen los enlaces sigma). Por otra parte, las partículas iluminadas se mueven durante el tiempo de exposición (segundos) debido a los coeficientes de expansión térmica distintos de la muestra y el soporte, y también porque el daño de la muestra genera y libera burbujas de gas. Los nuevos detectores son más sensibles, lo que permite reducir el tiempo de iluminación. También son más rápidos, lo que permite sustituir una exposición de varios segundos por muchas exposiciones breves que dan lugar a una “película”. Estas “películas” se analizan informáticamente para detectar los movimientos de cada partícula y revertirlos, recentrando cada “fotograma” a nivel de partícula y consiguiendo que su foto sea menos borrosa. Se ha conseguido resolver estructuras de proteínas a 2.2 Å de resolución (β-galactosidasa)
