Lección 21. Síntesis de péptidos y DNA

  1. Síntesis de péptidos en fase sólida
  2. Síntesis de DNA en fase sólida
  3. La PCR
  4. Servicios de secuenciación de ADN

Para saber más:

Nobel Prize in Chemistry 1984 a Bruce Merrifield

"For his development of methodology for chemical synthesis on a solid matrix"

Nobel Prize in Chemistry a Kary B. Mullis

“for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method”

Dancing naked in the mind field by K.B. Mullis

  1. Síntesis de péptidos en fase sólid. Permite sintetizar péptidos pequeños difíciles de expresar en bacterias, incorporar aminoácidos no codificados genéticamente y modificar el esqueleto de péptidos y proteínas. Suele realizarse en sintetizadores automáticos. El péptido se sintetiza desde su extremo C-terminal, que está unido a pequeñas bolas sólidas, porosas e insolubles. Así, los reactivos de la fase líquida y los subproductos de la síntesis pueden ser eliminados fácilmente por filtración. Una vez sintetizado, se suelta con TFA. Para incorporar los aminoácidos se realizan ciclos repetitivos de acoplamiento-lavado-desprotección-lavado. Es clave obtener en cada ciclo un rendimiento muy elevado. Con rendimiento del 99 (95) %, un 26-péptido se sintetiza con rendimiento del 77(25) %. Además el rendimiento disminuye al alargarse el péptido y no se suelen sintetizar péptidos mayores de 70 residuos. Los aminoácidos se utilizan con el grupo amino protegido (e.g. con t-boc: tertbutiloxicarbonil- o Fmoc-) y el carboxilo activado (con DCC: dicicloexilcarbodiimida).
  2. Secuenciación de DNA en fase sólida. Es una técnica muy útil al proporcionar de forma rápida y barata oligonucleótidos con la secuencia deseada que se pueden utilizar como oligonucleótidos antisentido, small interfering RNA (siRNA), cebadores para secuenciación o para amplificación (PCR), sondas para detectar DNA o RNA complementario por hibridación, herramientas en mutagénesis dirigida para introducir mutaciones o sitios de restricción, y para sintetizar genes artificiales. La síntesis se realiza de forma automatizada en dirección 3′ –> 5′ por técnicas de fase sólida usando como monómeros reaccionantes fosforamiditas de 2’desoxinucleótidos debidamente protegidos. Al terminar la síntesis, el oligonucleótido se libera de la fase sólida y se desprotege. Se suele limitar a oligonucleótidos de hasta 200 nucleótidos a causa de la acumulación de errores.
  3. La PCR. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción sintética in vitro que produce, a partir de una molécula de DNA que actúa de molde, un gran número de copias del segmento deseado de la misma. Una vez amplificado, resulta más fácil clonarlo y secuenciarlo, permitiendo identificar mutaciones, organismos patógenos y personas. La reacción utiliza cebadores que delimitan la región a copiar y una DNA polimerasa termostable (g. Taq polimerasa procedente de Thermus aquaticus que resiste las altas temperaturas necesarias para separar las hebras de DNA al final de cada ciclo. El proceso está automatizado mediante un aparato llamado termociclador que permite calentar y enfriar los tubos que contienen unos 100 µL de mezcla de reacción.
  4. Servicios de secuenciación de ADN. Éste, por ejemplo